Dragi prijatelji Shroomeri,
ovo je vrlo interesantna tema, i bice bi drago da podelim sa vama neka iskustva sa agarom. Od kada sam poceo raditi sa agarom, nisam nikad prestao,jer to je najefikasniji nacin za odrzavanje kulture dobrog soja gljive, naravno ukoliko uspete da izolujete kvalitetan micelij. Danas je nezamislivo razviti dobru kulturu gljive bez upotrebe hranljivih podloga. Kako u moru spora pronaci bas one dve, koje ce se upariti u hife i stvoriti dobru mrezu micelija?
U pocetku sam naravno eksperimentisao sa sporama, i islo je dobro dok sam koristio spore kupljene kod spore vendora, sterilno upakovane u profi laboratorijama. Kada sam poceo sam da vadim spore i da ih inokuliram, krenuli su i ozbiljni problemi sa kontaminacijom. Pokusavao sam i sa tekucim kulturama npr 4% meda i slicno, ali osim dobre tekuce plesni, nisam nista bolje uspevao da uzgojim. Sta se ustvari tu desava?
U miceliju tecne kulture, osim micelija gljive, pluta jos milion raznih organizama, sto se moze videti na mirkoskopu jaceg zooma. Spore na cistoj H20 imaju znatno manje sranja, ali opet ih imaju. Zato je najbolje krenuti od spore na agar, ili jos bolje sa tecne kulture na agar, sto cu kasnije objasniti. Upotreba 3% peroxida kod transfera je obavezna, samo drugim nacinom od ovog koji sam video u threadu.
Prvi eksperimenti sa agarom su mi odmah dali rezultate, jer sam uspeo da nabavim kvalitetne stvari za moj agar recept. To je bio agar i light malt extract iz MM.org , nisam tada koristio pepton. Najobicniji MEA recept, 2$ jecmenog ekstrakta, 2% agara, ostatak H20, bez kvasca. Med jeste dobra i slatka podloga za micelij, ali je isto tako i dobra za plesan, pa ukoliko zelite da izbegnete beneton boje na petriju, moj je savet da izbegnete i med.
Prvo se prokuva(do 5 min) smesa u nekoj posudi sa odgovarajucom kolicinom H2O, napuni se tegla ili boca i sterilise se pola h, nakon pola h vadi se iz sterilizatora i ceka da se ohladi do onog trenutka kada moguce drzati teglu (oko 50C). Sporangije plesni, najcesce trikoderme, termicki umiru na malo vise od 40C, pa je zato bolje sipati vruc agar u petrijke. Ubrzo nakon toga nakapati 5-7 kapi u petrijke, nije lose ako agar pliva u peroxidu. Da bi se na takav petri razvila kultura, potrebno je staviti najlepse parce micelija sa druge petri solje, najlepsim podrazumevam 0.5-1cm2 rizomorfni komad bez pufni,flafija ili cega vec, beo i mrezast drugim recima.
E sad malo oko izolacije. Naveo bih 2 nacina:
1. Nije lose krenuti sa spore na agar,u ovom slucaju bez peroxida, ali obratite paznju kako stavljate spore na agar. Ljudska glupost/spretnost je veoma bitan faktor kod uzgoja gljiva. Foliju sa sporama otvoriti i postaviti na 70% alkohol potopljenu salvetu, i grebalicom (neki 20-30cm tanki dugacki predmet, moze deblja zica, a moze i skaplel ili bilo sta) zagrebati malo spora i razmazati ih na centar solje, slobodno umocite grebalicu u agar. Vazna napomena: NIKAKO ne istresati spore iz kesice na agar, jer se tu zajedno sa sporama istresu i sporangije plesni i sve ono sto ne zelimo da uzgajamo na petriju. Naravno grebalicu prvo spaliti plamenom i ohladiti alkoholnom salvetom ili ostaviti da se ohladi. Sve to uraditi sto brze i spretnije, bez mnogo cekanja, i sa sto manje nespretnih poteza.
2. i verovatno bolji nacin je da napravite tecnu kulturu od spora, samo sto umesto meda je boilje koristiti dextrozu, ili jako malo jecmenog slada ili extrakta. Dobra alternativa je "gustin" ili extrakt jecmenog slada. Onaj recept od 4% za tecnu kulturu treba pretvoriti u 1-2% a moze i manje od 1% . Sto sladja tecna podloga, to vise sranja, a micelij se vrlo lepo kolonizuje i na slabim tecnim podlogama. Pustiti da se micelij razvije nekih 7 dana na 25-27C temperaturi uz muckanje svaki dan bar 2 puta(moze da se napravi magnetna mesalica od kulera i celicnom kuglicom u tegli) i posle ga treba drzati u frizideru. Nakon toga treba prsnuti malo tecnog micelija na peroxidni agar, i vec nakon 2-3 dana se vidi rezultat, naravno pored micelija lako se tu stvori i jos nesto drugo, ali je mnogo lakse izdvoji dobar komad micelija za dalji transfer, i kasnije treba manje transfera da se stigne do onoga sto svi zele, a to je najcistija rizomorfija na celom petriju. Rizomorficnost je samo karakteristika miclija, on ne mora biti rizo, ali je rizo 100% micelij dok pufna moze biti i nesto drugo. Kada se prsten micelija priblizi rubu petrija, onda petri treba cuvati u nekom hladnjaku ili frizideru sve do upotrebe.
U oba slucaja je VRLO bitno raditi transfere sve dok se ne dodje do skroz ciste kulture, a onda se od te kulture opet moze reversno napraviti cistija tecna kultura, radi lakse inokulaciju, ali i ne mora.
Kloniranje je najbolja alternativa, tako da se izolacija sa spore radi samo jednom, a kasnije je lakse odrzavati strain klonirarnjem lepe mlade gljive, u punom uzrastu (nikako matore, mogu i abortusi), isecanjem komadica mesa izmedju kapice i drske(gljiva treba da se rascepi uzduz na pola, i onda secirati malo mesa) i taj komadic treba staviti opet na peroxidni agar, a kod abortusa nije lose potopiti ga na kratko u peroxid.
Peroxidni petri mozete otvoriti i u kafani, nece se kontaminirati, tako da je parafilm pozeljan samo na petrima bez peroxida.
Razlicite gljive, razlicito reaguju na podlogu, zato kod nekih strainova treba praviti slabiju podlogu, a kod nekih jacu, naravno tu je i pepton kao antibakterik (neko koristi i ZnO), treba kombinovati. Npr Agaricus bisporus nikada nisam uspeo da kloniram (kupljenu u prodavnici), dok shiitaku jesam. Pleurotusi rastu na bilo kojoj podlozi, ali su dosta agresivni i cesto ga treba presadjivati.
Mislim da sam sve napisao, ima jos par sitnica ali ne mogu se setim
Ziveo agar!
)
